水中总大肠菌群的检测及分离鉴定
一、概述 试验方法及结果 多管发酵法 滤膜法 样品名称 接种量(m1) 初发酵试验阳性管数 总大肠菌群(个/L) 过滤量(ml) 大肠菌群(个) 总大肠菌群(个/L) 香洲水厂出厂水 300 0 <3 333 0 <3 市府饭堂管网水 300 0 <3 333 0 <3 拱北市场管网水 300 0 <3 333 0 <3 西江河水 55.5 5(10ml) 2(1.0ml) 490 100 42 420 桂山岛山水 55.5 2(10ml) 50 333 13 39
总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌与医学细菌学分类中的大肠杆菌不同。它包括肠杆科的四个菌属：艾希氏菌属、柠檬酸杆菌、克雪伯氏杆菌以及副肠杆菌属[1、2]。在饮用水的微生物安全监测中，大肠菌群是水的粪便污染指标菌，以该菌的检出情况来表示水中有否粪便污染及其程度。因为粪便中可能会带有一些肠道致病菌，所以水中总大肠菌群数的高低，也反映了其对人体健康危害性的大小。
本文对香洲水厂出厂水、市府饭堂管网水、西江河水和桂山岛山水进行了总大肠菌群的检验。检验方法采用多管发酵法和滤膜法[1]。两种方法测定结果基本一致。并对检验中培养所产生的菌落进行了分离鉴定，分离得到3株艾希氏大肠杆菌、2株柠檬酸杆菌和3株产气克雷伯氏杆菌。
二、检测
1.仪器
显微镜、放大镜、革兰氏染色用有关器材、试管、平皿、刻度吸管、滤膜、无齿镊子、抽滤设备、水浴锅、恒温箱、水箱及消毒、灭菌用有关器材。
2.培养基
2.1多管发酵法：
2.1.1初发酵试验：乳糖蛋白胨培养液及其三倍浓缩液；
2.1.2平板分离：品红亚硫酸钠培养基；
2.1.3复发酵试验：乳糖蛋白胨培养液。
2.2滤膜法：
2.2.1初培养：品红亚硫酸钠培养基；
2.2.2复检试验：乳糖蛋白胨培养液。
3.培养条件
3.1培养温度：37℃
3.2需氧条件：常压空气下培养
3.3培养时间：1～2天
4.结果
培养特性：在乳糖蛋白胨培养液上培养一天后，西江河水、桂山岛山水的初发酵管中，部分变黄变浊，并伴有气泡，或出现絮状沉淀，均带有粪臭味。将产酸产气及只产酸的发酵管分别接种于品红亚硫酸钠培养基培养一天后，平板上出现多种菌落，其中有三种典型菌落：紫红色，带金属光泽，圆形，边缘整齐，凸，润，1～3mm大小；深红色，圆形，边缘整齐，凸，润，1～3mm大小；浅红色，中心色稍深，稍园或不规则，扁平，发粘，2～4mm大小。西江河水、桂山岛山水的滤膜在品红亚硫酸钠培养基上经初培养后，也出现了上述菌落。
形态特征：三种典型菌落的生长菌呈革兰氏阴性，无芽孢，菌体大小约0.5～l×1～3μm，杆状，两端钝圆。其中前面两种菌落的生长菌能运动，不形成荚膜；而菌落发粘的生长菌不运动，部分可形成荚膜。
镜检后将符合大肠菌群性状的菌落接种于乳糖蛋白胨培养液，培养一天后，有产酸产气现象，证实有大肠菌群存在。检测结果见表1。
三、分离鉴定
对河水和山水在检测中培养产生的三种典型大肠菌菌落进行纯分离培养检查。
1.鉴定培养基
MFC培养基，煌绿肉汤培养基，西蒙氏柠檬酸钠琼脂，氰化钾肉汤培养基，葡萄糖酸钠肉汤培养基。
2.培养条件
2.1 培养温度：33℃ 37℃ 44℃
2.2 需氧条件：常压空气下培养
2.3 培养时间：1～2天
3.分离鉴定方法
将平板分离得到的三种菌落再分别接种于品红亚硫酸钠培养基进行纯培养后．挑紫红色带金属光泽的菌落，移植MFC培养基和煌绿肉汤培养检查；挑深红色或红色无光泽的菌落移植柠檬酸钠琼脂和氰化钾肉汤培养检查；挑浅红色(粘、大)的菌落移植葡萄糖酸钠肉汤培养检查：
4.结果
从两份不同样品中，分离鉴定出3种共8株肠杆菌．其种类分布及来源见表2。从表2可见．由西江河水分离的肠杆菌有：艾希氏大肠杆菌、柠檬酸杆菌和产气克雷伯氏杆菌。由桂山岛山水分离的肠杆菌有：柠檬酸杆菌和产气克雷伯氏杆菌。其形态特征如1．4中所述。
培养特性：
在MFC培养基上培养一天后，艾希氏大肠杆菌菌落l～3mm大小．圆形．边缘整齐．凸．润．蓝色，中心色稍深；在煌绿肉汤中培养一天后，产气。
柠檬酸杆菌在氰化钾肉汤中培养两天后，产气．醋酸铅滤纸条颜色变黑：在柠檬酸钠琼脂上培养2天后．出现圆润小的菌落。
产气克雷伯氏杆菌在葡萄糖酸钠肉汤中培育两天后．加入Benedict试剂．置于沸水浴中10分钟后，出现褐色沉淀。
生化试验：
对所分离的肠杆菌进行生化试验：靛基质生成试验、甲基红试验、V.P.试验、硫化氢产生试验、明胶液化试验等。试验结果见表2。
检测结果(表1)
分离肠杆菌代表株生化试验表(表2)
|
内容 样品名称 |
菌种名称 |
分离株数 |
代表菌株 |
|
靛基质 |
甲基红 |
V.P. |
硫化氢 |
明胶液化 |
|
西江河水 |
艾希氏大肠杆菌 |
3 |
E1-1 |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
|
柠檬酸杆菌 |
1 |
C1-1 |
- |
- |
+ |
- |
+ |
- |
|
|
产气克雷伯氏杆菌 |
1 |
K1-1 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
|
桂山岛山水 |
柠檬酸杆菌 |
1 |
C2-1 |
- |
- |
+ |
- |
+ |
- |
|
产气克雷伯氏杆菌 |
2 |
K2-2 |
= |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
|
艾希氏大肠杆菌(对照菌株．引自上海生化所) |
+ |
+ |
+ |
- |
= |
= |
|||
四、讨论
采用多管发酵法和滤膜法检测饮用水、水源水的总大肠菌群．两种方法结果基本一致，前者的数值相对较大，可能是因为多管发酵法采用的MPN法存在正的统计误差。滤膜法可以除去水样中最影响细菌生长的成分，对较洁净的水又可以增加其滤过量．有利于提高检测的准确度和精密度，检测出厂水、管网水等洁净度高的水特别适用。对于浊度较大的水源水．采用多管发酵法较为合适。
西江河水的总大肠菌群数量较多，经分离鉴定含有艾希氏大肠杆菌、柠檬酸杆菌和产气克雷伯氏杆菌，这可能是河水前期和近期曾受到动物粪便污染。桂山岛山水含有少量的大肠杆菌，经分离鉴定含有：柠檬杆菌和产气克雷伯氏杆菌，这可能是山水前期曾受到动物粪便污染。因此，河水和山水均可能带有其其他的肠道致病菌，而大肠杆菌在一些情况下也会导致毒血病和某些炎症，可见河水和山水均不宜直接作为饮用水使用。
水源水中细菌种类繁多，大肠菌群作为粪便污染指标菌而提出来．艾希氏大肠杆菌因存在于温血动物肠道内，而被称为粪性大肠菌，粪性大肠菌在水源水的监测中已日趋重要：上述三种肠杆菌是大肠群中的常见菌，对其分离鉴定的目的是为了熟悉水中大肠菌群的形态特征、培养特性及其生化反应
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