浅谈混合培养微生物好氧降解对硝基苯胺的特性研究
摘要：本文以对硝基苯胺为目标污染物，通过富集培养某化工厂好氧处理池的污泥，获得了对该污染物降解效果较好的混合培养微生物。用该微生物作为降解菌源，对对硝基苯胺的生物降解特性进行了初步的实验研究。
1.前言
硝基苯胺（NA）的三种异构体：邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺，是印染、橡胶、制药、塑料和油漆等行业的重要原料，是染料工业的中间体。这3种化合物可通过呼吸道、消化道而摄入体内,使氧和血红蛋白变为高铁血红蛋白，影响组织细胞供氧而造成内窒息，且被认为对人体有很强的致癌性。苯胺类化合物对环境的污染一直被人们所关注，我国把苯胺类化合物列入环境中的重点污染物，并制定最高容许排放浓度5mg/L。此类化工废水治理较为困难，国内研究较少，至今为止绝大多数采用物理、化学的方法加以处理，但这些方法处理费用偏高，操作要求较为严格，实际上难以推广运用。因而迫切需要寻找一些行之有效的、费用相对低廉的处理方法。本文以对硝基苯胺为目标污染物，通过富集培养某化工厂好氧处理池的污泥，获得了对该污染物降解效果较好的混合培养微生物。用该微生物作为降解菌源，对对硝基苯胺的生物降解特性进行了初步的实验研究。
2.实验材料与方法
2.1菌种来源
菌种来自某化工厂废水处理系统好氧池污泥
2.2试验仪器及设备
恒温摇床；7500分光光度计；Ph计；高速离心机
2.3培养液及微量元素
降解菌培养基：K2HPO4·3H2O,430mg/L；KH2PO4·7H2O,170mg/L；MgSO4·7H2O,22.5mg/L；CaCl2,27.5mg/L；NaEDTA,100mg/L；Na2HPO4·7H2O,668mg/L。
基础无机盐培养基：KH2PO4,1000mg/L；Na2HPO4·12H2O,7000mg/L；柠檬酸铁，40mg/L；CaCl2·2H2O，100mg/L；MgSO4·7H2O,300mg/L；PH，7.35。
YPS培养液：酵母粉10g/L；蛋白胨10g/L；氯化钠5g/L。
微量元素（TMS）：FeCl3·6H2O；ZnCl2·4H2O；CoCl2·2H2O；Na2MoO4·2H2O；CaCl2·2H2O；CuSO4·5H2O；H3BO4；HCl等。
基础无机盐/TMS/YE培养液：每1L无机培养液中添加3mL微量元素和1g无菌酵母粉。
2.4研究内容与方法
2.4.1降解菌的分离
2.4.1.1富集培养
菌种驯化过程在30℃的恒温室中进行。首先取5mL新鲜的活性污泥加入到盛有50mLYPS培养液的250mL锥形瓶中，在120r/min转速下，连续振荡培养24h，然后从中取10%培养液转接到新鲜的YPS培养液中。在相同的条件下继续培养24h，从中取5mL作为接种菌液，加入到含20mg/L对硝基苯胺的基础无机盐/TMS/YE培养液中，10天左右培养液原黄颜色褪去。再取10mL培养液转接到新鲜的含对硝基苯胺基础无机盐/TMS/YE培养液中，两天后培养液黄颜色也褪去。把此种培养液作为降解试验的接种菌液，菌体的OD值大约1.2左右，降解特性试验中菌体的接种量均为10mL。
2.4.1.2纯培养
从降解速率较高的富集培养物中取样，在含有对硝基苯胺平板上划线分离，放置于30℃恒温室内培养数天，观察菌落生长情况，把形成的耐受力强单菌落挑斜面保存（即为纯培养物）。
2.4.2对硝基苯胺降解特性试验
pH值：对硝基苯胺初始浓度约为50mg/L，调节混合培养液初始pH值，置于30℃恒温室振荡培养36h后，以初始培养液为空白参比测定OD值以及对硝基苯胺去除率，确定混合培养微生物生长适宜的pH值范围。
外加碳源：对硝基苯胺初始浓度约为50mg/L、100mg/L，pH值约为7.5，分别添加0g/L、0.5g/L、1.0g/L葡萄糖条件下，探明微生物能否利用对硝基苯胺作为生长的唯一碳源、氮源和能源，以及不同葡萄糖量对微生物生长及对硝基苯胺去除率的影响。
基质浓度：对硝基苯胺初始浓度约为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，pH值约为7.5，间隔一定时间取样，测定培养液中对硝基苯胺浓度、pH及OD值的变化。通过微生物的生长曲线、基质降解曲线等过程来分析该混合培养微生物的基本特性。
2.5分析项目和测定方法
对硝基苯胺浓度：采用分光光度法，在最大吸收峰（λmax=360nm）测定其吸光度。混合液经9000r/min高速离心5min，取上清液测定。根据标准曲线推算其浓度。若对硝基苯胺浓度超过10mg/L均稀释后测定。
菌体浓度OD值：采用分光光度法，混合液充分摇匀后直接在波长λ=600nm测定其吸光度。溶液的菌体浓度等于实际测定的OD值减去空白值（不接菌液）的OD值。
pH值：混合液充分摇匀后直接用pH计测定。
3.结果与讨论
3.1pH值对降解的影响
混合培养微生物对硝基苯胺初始浓度约为50mg/L，在不同初始pH值条件下，经30℃恒温振荡培养36h后，其菌体浓度OD值和对硝基苯胺去除率关系。从图中可以看出微生物生长适应pH值范围较宽，在初始pH值为6.5～8.5条件下生长均较好。这与AdrianSaupe、Zeyer、Lauzening等国外研究者的研究结果相吻合——能降解硝基苯类化合物的Pseudomonassp.、Comamonastestosteroni、Bacillussp.、Acidovoraxdelafiedii菌属最适pH值为6.5～8.5，可以说pH值也是影响降解速率的重要因子。实验中发现，混合培养微生物初始pH值为3.2、3.7时，其菌体OD值均小于0.4，去除率也很低；pH值为3.7时去除率为19.5%，而pH值为3.2时几乎未见有降解。这说明该混合培养微生物中对硝基苯胺降解菌不适宜在较低的pH值下生长，但仍具有一定的耐酸性。
值得注意是，当初始pH值大于8.5，甚至达到10.2时，混合液OD值还是比较高，均超过1.2，但对硝基苯胺去除率几乎为零。这是由于混合液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母膏的缘故。葡萄糖作为外加碳源，提供了微生物生长的电子受体，促进了非对硝基苯胺降解菌的生长。
3.2不同碳量对降解的影响
混合微生物能利用对硝基苯胺作为生长的唯一氮源，适量的外在碳源对微生物的生长有很大的促进作用，混合液的菌体浓度随外在碳源（葡萄糖）添加量的增加而增大。但混合液中不添加葡萄糖时，即对硝基苯胺作为微生物生长的唯一碳源、氮源和能源，菌体浓度明显小于添加外在碳源的混合液，最终OD值只有0.05。
葡萄糖添加量对对硝基苯胺去除率也有影响。当底物对硝基苯胺浓度为41mg/L时，不添加外在碳源，96小时内去除率为34.7%。而添加0.5g/L葡萄糖外在碳源，前24h对硝基苯胺降解速率要快于添加1.0g/L葡萄糖的培养液，24h之后其降解速率要慢于后者，但最终去除率都能达到97％左右。从图4可以看出，当底物对硝基苯胺浓度为83mg/L左右时，葡萄糖的添加量越多，对硝基苯胺的降解速率越快，在24h之后表现的更为明显，最终的去除率分别为16.8％、72.2％和96.8％。
从以上的分析可以说明对硝基苯胺作为难降解有机物，并不是混合微生物新陈代谢理想的碳源。有研究表明，此种难降解化合物在被降解之前，往往需要利用一些简单的碳源。混合微生物利用初级碳源（葡萄糖）生长，并产生相应的诱导酶，从而使对硝基苯胺得到降解。
3.3不同底物浓度对降解的影响
前12小时内4种培养液菌体生长均达到对数增长期，菌体个数成对数增长，但此时对硝基苯胺浓度并未急剧下降。这是由于培养液中添加了1.0g/L葡萄糖和1.0g/L酵母粉,在初始阶段微生物以葡萄糖和酵母粉中的碳作为初级碳源，而且酵母粉中含有维生素B2，促进了微生物的生长。对硝基苯胺去除率随底物浓度的增加而下降。当底物浓度较低时（43.03mg/L），对硝基苯胺降解速率明显要高于其它底物浓度较高的培养液。然而当底物浓度增加到一定程度（83.03mg/L）后，基于高浓度有机物毒性对酶的抑制作用，降解速率比较缓慢，降解速率也比较相近。
3.4混合培养与纯培养对硝基苯胺降解效率的比较
混合培养对硝基苯胺的去除率要明显高于纯培养。纯培养对硝基苯胺的最高去除率只有0.07左右，比混合培养97％的去除率要小很多。有研究表明聚乙烯醇（PVA）的生物降解需要混合菌完成，一般是pseudomonassp.和Alealigenessp.或两株不同的pseudomonassp.，它们之间靠一种共生关系来完成PVA的降解。Murray[10]对Bacteroidescellulosolvens和Clostridiumsaccharolyticum混合培养分解纤维素进行研究发现，前者分解纤维素进行研究发现，前者分解纤维素为后者提供生长所需碳源，后者又可利用前者产生的有毒中间产物，消除对前者分解纤维素的反馈抑制。Mori[11]认为，ClostridiumThermohydrosulfuriumYM3和C.ThermocellumYM4混合培养降解纤维素效果明显高于单菌培养，主要原因是两菌互相提供了对方所需的生长因子。本实验的结果也可以证明，混合菌对有机物的去除率要高于单一菌株，但混合菌株之间是以何种关系促成有机物的降解有待于进一步研究。
3.5对硝基苯胺降解的动力学分析
从上述3.2的分析中可以看到，适量的外在碳源可以大大提高对硝基苯胺的去除率。为了解混合培养微生物降解对硝基苯胺的动力学性质，先假设对硝基苯胺降解遵循一级反应动力学。根据一级反应动力学公式，对试验数值进行整理，分别做曲线，并拟合求解反应速率常数K，见表1。
从相关系数可以看出，混合培养微生物降解对硝基苯胺反应可以近似用一级反应来描述。另外，从降解速率常数K值的大小可以进一步说明补充碳源对不同底物浓度以及碳源量在降解对硝基苯胺过程中的作用是不一样的。在低底物浓度（41mg/LNA），补充0.5g/L葡萄糖可以大大提高对对硝基苯胺的降解作用，但过多的外加碳源量（1.0g/LGlu）反而降低了对硝基苯胺的降解速率。这是由于过多的葡萄糖对对硝基苯胺的降解起到竞争性抑制作用。在高底物浓度（83mg/LNA），随着外加碳源量的增加，对硝基苯胺的降解速率也相应的增加，但降解速率要慢于低底物浓度的培养液。
表1对硝基苯胺在不同浓度下的降解速率常数
Table1ThedegradationratecontantatdifferentinitialconcentrationofNA
项目41mg/LNA83mg/LNA
0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu0g/LGlu0.5g/LGlu1g/LGlu
K×103/L(g·h)-1相关系数3.50.8601480.912141.40.9071.50.85713.50.985635.50.9082
4.结论
通过富集培养某化工厂的活性污泥获得降解对硝基苯胺的混合培养微生物。在好氧条件下对硝基苯胺具有较高的降解速率4.1mg/（L·h）。降解反应遵循一级反应动力学。实验确定了该混合培养物的适宜生长条件：pH为6.5～8.5，温度为30℃左右。该混合培养物能利用对硝基苯胺作为生长的唯一碳源、氮源、能源，但降解速率较慢。适量的外加碳源可以大大的提高对硝基苯胺的降解速率，但在低底物浓度时过多的碳量会对对硝基苯胺的降解起到竞争性抑制作用。混合培养微生物的降解速率要明显的高于纯培养的单一菌种，因此寻找高效好氧降解菌，仍是今后研究的一个重点。
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