饮用水安全评价指标——Vero细胞培养法
饮用水安全是一个国家和地区发展水平和生活质量的重要标志，而我国不仅人均水资源拥有量只有世界平均水平的四分之一，而且随着经济建设的快速发展，水污染形势依然严峻，越来越多的化学物质在生产、运输和使用过程中将不可避免地进入饮用水源，而各种新材料在饮用水行业的使用也可能造成其中微量化学物质的溶出，这些因素使得目前饮用水中化学物质种类不断增多，对人体健康和生态环境造成了日益严重的危害，因此，其安全评价具有重要意义。
由于饮用水中化学物质具有种类繁多，浓度极低的特点，单一的理化指标无法反映水体中各类物质的协同效应。传统的生物试验法，如鱼类试验和蚤类试验，因灵敏度较低，达不到检测痕量化学物质的要求。近年来兴起的一些基于分子水平和细胞水平的方法，如发光细菌法和遗传毒性法，被广泛用于饮用水及相关材料(浸泡液)毒性物质的检测。本文根据有关材料系统介绍了现有饮用水及相关材料安全评价技术的原理、过程和应用，分析了各种检测方法的优点和不足，提出发展依据细胞形态变化的Vero细胞培养法——一种生物安全评价技术的原理、过程和应用，以为大家提供一种广谱、可靠、灵敏、简单易行的综合测试技术。
尽管仪器法的发展使饮用水中微量物质的检测变得更加方便、快速，但检测成本偏高，并且由于水中各种化学物质之间的协同作用，单一的理化指标无法反映饮用水的综合毒性。传统的生物试验法(如鱼类、藻类试验法)可以检测水体的长期和综合毒性，但其灵敏度较低、所需时问长，不适于饮用水的安全评价。从20世纪80年代以来，随着现代生物技术的快速发展，生物体(特别是微生物)中一些分子与细胞水平的变化被用作衡量水体安全的指标，并以此为基础建立了一些快速、灵敏的检测和评价水体生物毒性的技术。
Vero细胞培养法英国于20世纪90年代，逐步发展和完善了一种细胞毒性检测法——Vero细胞培养法，以用于饮用水及相关材料的综合安全评价。该法的原理是利用来源于非洲绿猴肾脏的Vero细胞(CCL一81)在正常情况下生长时，呈不规则三角形状；而在含一定浓度有害化学物质的培养基中生长时，则由三角形转变为圆形或椭圆形的特点来判断饮用水及相关材料的综合安全性(材料的安全性评价通过测定材料浸泡液的综合生物毒性进行)。
Romem用Veto细胞测试氯化汞的毒性，并确定了能够检测到毒性的氯化汞的浓度范围。Fernandez采用Vero细胞的形态学分析和生化分析确定了五氯苯酚对哺乳动物细胞的毒性已有研究表明，很低浓度的有害化学物质就可造成Vero细胞变形(高浓度造成细胞死亡或繁衍速度下降)，因此，其反应灵敏度极高，而且对不同性质化学物的反应具有普遍适用性(重金属离子、极性与非极性有机物的超标都可造成细胞变形)。同时，非洲绿猴肾脏的Vero细胞与人体细胞高度同源，检测时间仅需48h因此，该方法是一种理想的饮用水综合安全评价手段。
Vero细胞变形试验可分为三个阶段，(1)在实验条件下建立和维持Vero细胞系生长；(2)将受试水样或饮用水相关材料的浸提液配制一批细胞培养基；(3)进行受试样品的细胞毒性试验，观察细胞形态变化。(1)试验水(Testwater)必须是不含有余氯的，这样以免对细胞系的生长产生毒害和抑制；(2)试验材料(testsample)需要用试验水清洗10min，去处其表面的杂质，以免对试验结果造成影响；(3)将清洗过的一定表面积的试验材料放人试验容器(Testcontainer)中，用试验水在23℃避光条件下浸泡24h；(4)进行材料浸泡液的Vero细胞毒性试验——配制含有不同剂量浸提液的培养基，准备细胞悬浮液，接种到培养皿中的细胞浓度在l03—105个/m2，以确保细胞对污染物较高的灵敏度，在CO2培养箱中37℃培养24～48h，然后在低倍光学显微镜下观察细胞形态；(5)如果培养皿表面能形成一个相互融合的、生长良好的细胞单层，则说明材料浸提液对细胞无毒性反应，实验结束；(6)如果材料浸提液对细胞的形态产生了影响(细胞变圆、无细胞单层)，那么应该对另外两个平行样再进行细胞毒性试验；(7)如果在两平行样的毒性试验中，都能形成一个相互融合的、生长良好的细胞单层，则说明材料浸提液对细胞不产生毒性反应，实验结束；(8)如果另两平行样品中仍有一个对细胞形态产生了影响(细胞变圆、无贴壁的细胞单层)，则说明材料浸提液对细胞产生毒性反应，实验结束。
他们考察了2，4，6一三氯苯酚(TCP)和饮用水相关材料(PVC管和一次性塑料水杯)的浸泡液致Vero细胞变形的灵敏度与相关性，并与四氮甲唑蓝(MTF)比色法进行了比较。结果表明：TCP对Vero细胞的毒性响应浓度为0.5mg／L，且变形细胞的比例与TCP浓度呈正相关，而MTY比色法测定低浓度TCP(<1.0mg/L)致Vero细胞增殖抑制率的结果不稳定；流式细胞仪AN—NEXINV—FITC／PI双染色法的检测结果显示，细胞膜损伤是Vero细胞毒性的早期表现特征，比细胞凋亡和坏死更灵敏；Vero细胞暴露于饮用水相关材料的浸泡液时，其变形细胞的比例随浸泡温度的升高而增加，而在相同条件下，MTF比色法测定的浸泡液对Vero细胞的增殖抑制率则呈现不规律变化。
他们以2,4，6一三氯苯酚(2，4，6一trichlorophenol，TCP)为例，采用MTF比色实验和ANNEXIN V—FITC／PI双染色一流式细胞技术研究了Vero细胞对有机化学污染物的毒性响应特征和敏感性，以期发现一种灵敏、可靠的表征微量化学物质综合毒性的方法．研究结果表明：1)TCP浓度对Vero细胞的毒性响应特征有决定作用。低浓度TCP(≤0．5mg·L-)即可使部分细胞从原有的刚性不规则三角形结构变为圆形或椭圆形，但细胞的生长未受明显抑制．TCP浓度在1～5mg·L-时，细胞生长开始受到抑制，表现为细胞增殖受到抑制及部分细胞凋亡或死亡，但增殖抑制率和TCP浓度之间的关系不明显．当TCP浓度大于5mg·L-时，细胞增殖明显受到抑制，且随TCP浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高．2)TCP作用时间对Vero细胞的毒性响应特征有显著影响。ANNEXIN V—FITC／PI双染色一流式细胞仪检测结果表明，TCP作用24h内Vero细胞毒性表现为以细胞膜的完整性受到损伤为主，凋亡或坏死细胞比例较小；而48h后，凋亡细胞的比例明显增加．细胞复壮实验结果进一步证实24h内形态发生变化的细胞并未完全坏死或凋亡。以上结果表明细胞形态变化和细胞膜损伤均为细胞毒性的早期表现特征，两者之间可能存在某种相关性，以此表征化学污染物的生物毒性具有较高的灵敏度，值得进一步研究。
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